第一篇新冠单细胞文献!|解读

前言

NGS系列文章包括NGS基础、转录组分析 （Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这）、ChIP-seq分析 （ChIP-seq基本分析流程）、单细胞测序分析 (重磅综述：三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程 （原理、代码和评述）)、DNA甲基化分析、重测序分析、GEO数据挖掘（典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step) - Limma差异分析、火山图、功能富集）等内容。

我们之前也发表过有关新冠病毒受体ACE2组织分布的解读，基本上是利用公共数据库对其分布及特异性进行分析，而这篇文章是研究团队利用新冠病毒感染进行的单细胞转录组分析，是第一篇报道新冠肺部免疫微环境的单细胞文献。这开启了单细胞分析在新冠方面的应用。

2020年2月23日，深圳第三人民医院在medRixv预印本上发表题为The landscape of lung bronchoalveolar immune cells in COVID-19 revealed by single-cell RNA sequencing的研究内容，对患者肺泡灌洗液（Balf）进行转录组分析及TCR分析，比较分析了重症患者和轻症患者的肺部免疫微环境。

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研究背景

（1）尚不完全清楚为什么有些患者会因相同的SARS-CoV-2感染而发展为重症，而其他患者却患有轻度甚至无症状；
（2）Human Coronaviruses（hCoVs）引起的呼吸窘迫综合征的免疫发病机制可能涉及干扰素产生紊乱、炎症反应过度和细胞因子风暴、中和抗体诱导无效或延迟以及特异性T细胞反应；

研究方案

sample：6名COVID-19患者的肺支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞，包括3例重症和3例轻度病例。分别进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞TCR-seq。

测序数据分析介绍：

1. 工具：

   Chromium Single Cell 5′ Library and Gel Bead Kit（10X  Genomics）；

2. 比对: GRCh38；

3. 筛选：

   Following criteria were then applied to each cell, i.e., gene number between 200 and 6000, UMI count above 1000 and mitochondrial gene percentage below 0.1；

4. 降维聚类：

   Seurat v3标准流程，PCs=50，使用UMAP进行展示；

5. 轨迹分析：

   Slingshot；

6. 调控网络：

   SCENIC;

7. TCR V(D)J测序分析：

   通过Cell Ranger V(D)J（v3.1.0）组装单个T细胞的TCR序列，鉴定CDR3序列和重新排列的TCR基因。

结果分析

COVID-19患者肺部免疫微环境解析

为了识别新冠感染后肺部的免疫微环境，作者对3例恢复期的轻症和3例重症患者BALF进行10X单细胞转录组测序，共收集到37820个细胞。患者的临床指征如table1所示。

table1

作者使用公共数据（8个正常人的肺组织）作为对照。在聚类分析中共发现36个细胞亚群，包括巨噬细胞、NK&T、B和浆细胞、上皮和内皮细胞。通过以下marker鉴得细胞类型：巨噬细胞（CD68）,T&NK（CD3D，KLRF1），B和浆细胞（MS4A1），上皮细胞（AGER，SFTPC，SCGB3A2，TPP3，KRT5），内皮细胞（VWF）和成纤维细胞（DCN）（图1）。与此同时，作者在重症新冠患者的BLAF中发现了低载量的病毒转录组，而在轻症和healthy control（HC）组中未发现这一现象，作者认为这是细胞破裂释放的污染所致。

然后作者对不同样本的细胞比例进行分析（图1f）。研究人员发现与健康对照相比，COVID-19感染的患者存在更高比例的T和NK细胞以及较低比例的上皮细胞。与轻症患者相比，重症患者含有更高比例的巨噬细胞，较低比例的T和NK（图1E和F）。总而言之，该数据显示了免疫细胞在面对COVID-19时会发生免疫细胞的招募增加，并且轻重症患者的免疫细胞比例有所区别。

图1. Single cell atlas of BALFs from SARS-CoV-2-infected lungs and controlled lung tissues.  HC1-HC8: healthy controls, M1-M3: mild cases, S1-S3: severe cases.

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重症新冠患者肺内巨噬细胞组成失调

在前期已经发现了肺内巨噬细胞比例有所增加，因此为了探究巨噬细胞的异质性，单独对巨噬细胞进行重新聚类，自动聚类为22个clusters(C1-C22)。除C15为DC细胞外，其余分别为Group 1(C9、C10，简称FCNhi)，Group2(C0、C6、C12、C16、C19，简称FCNlowSPP1+)，Group3(C7、C8，简称FCN-SPP1+)，Group4(C1-C5、C11、C13、C14、C17、C20、C21、C22，简称FABP4+），如图2所示；

作者发现重症患者的巨噬细胞组成与轻症和健康人存在区别较大 (图2C) ，并且这种区别在FCN1、SPP1和FABP4的表达水平上也有体现。对照组和轻度COVID-19患者高表达FCN1，而重度COVID-19患者高表达SPP1和FABP4（图2E）（注意：这里应该是作者笔误，图中表现为对照和轻度高表达是FABP4，重度高表达的是FCN1和SPP1）。这些数据表明，在重症COVID-19患者中，肺巨噬细胞群体的平衡失调，表现为Group1 单核细胞衍生巨噬细胞（FCN1+）、Group2和3 巨噬细胞（SPP1+）显着增加，而Group 2 肺AM（FABP4+）几乎完全丧失。

为了进一步了解上述4组巨噬细胞的差异，作者进行了基因表达（GEX）分析（图2F）。Group1表达与炎性单核细胞相关的基因S100A8、S100A9、VCAN、FCN1、CD14、SELL。Group2表达趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CXCL9、CXCL10、CXCL11和ISG APOBEC3A、ISG15、ISG20、GBP1、ITITM3、MX1等。Group3表达免疫调节基因A2M、GPR183、CCL13等以及促纤维化基因TREM2、TGFB1、SPP1。Group4表达典型的AM基因，例如FABP4、FABP5、INHBA、MACRO、TFRC、MRC1等。

进一步的GSEA和GO富集分析显示Group1、2和3组更加活化和炎性功能，而Group4具有脂质代谢功能（图2G和图S3B）。使用SCENIC，作者推测了巨噬细胞组中的转录因子（TFs）活性（图2H）。作者发现Group1、2和3组巨噬细胞中的STAT1，STAT2和多种IFN调节因子（IRF）活性增强，这与它们的炎症表型和功能一致。作者还鉴定了M2样的TF，Group3巨噬细胞中的MAF和CREB1，以及AM-TF，Group4巨噬细胞中的PPARG和BHLHE41。最后，作者还分析了巨噬细胞亚群的分化轨迹并发现了一条线性路径：从Group1开始，然后是Group2和3，最后是Group4（图2I）。

图2. Perturbed CD68+ macrophage compartments in severe COVID-19

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COVID-19患者肺部BALF中T细胞和NK细胞反应的特征

NK和T淋巴细胞是针对病毒感染的免疫效应细胞。已有研究表明(Zheng J et al.)[1]，强烈的早期T细胞反应在急性呼吸道感染期间在病毒清除中起关键作用。对T和NK细胞重新聚类分群分为5个亚群 (图3A和3B) ，其中NK细胞高表达KLRF1、KLRC1和KLRD1。CD8+ T细胞高表达CD8A和CD8B，CD4+T细胞（CCR7+）高表达CD4和IL7R，Treg细胞表达CTLA4+FOXP3+IL2RA+，增殖细胞表达TYMS+MKI67。

与对照组相比，新冠患者中的NK和T细胞比例明显增高 (图1F和3C）。与轻症患者相比，重症患者中CD8+ T细胞比例较低，增殖细胞比例较高 (图3C和3D) 。GEX分析显示CD8+ T细胞高表达效应分子的基因，如GZMA、GZMK、FASLG、CCL5等，并且表达固有T细胞markers，ITGA1、CXCR6、JAML等，表明其似乎在免疫防御中起重要作用。

轻度患者中肺CD8+ T细胞数量的增加可能表明CD8+ T细胞在清除病毒中的作用，而重症患者中较高水平的T细胞增殖则值得探究。作者认为这可能与过度炎症引起的旁观者激活或严重COVID-19中感染的延迟反应有关。为了进一步了解轻度和重度患者之间每个NK和T细胞亚群的相关功能状态，研究人员进行了GEX分析。发现轻度病例CD8+ T细胞中T细胞的活化、迁移、钙离子信号分子相关基因被上调，而重症患者CD8+ T细胞中的病毒反应、代谢产物和能量生成以及翻译起始分子相关基因被上调（图3E和3F）。因此，这些数据证实了假设，即轻症患者中CD8+ T细胞更有助于清除病毒，而重度患者中的CD8+ T细胞正在准备增殖。

图3. Analysis of the BALF T and NK lymphocytes in COVID-19 patients

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COVID-19患者的BALF中单细胞TCR免疫组库的特征

当遭遇抗原时，特定的B和T淋巴细胞通过克隆扩增产生反应，从而产生具有相同特异性的效应细胞和记忆细胞，以应对入侵的病原体。扩增的抗病毒T细胞克隆可能在病毒感染期间根据不同情况发挥保护或致病功能。

作者利用单细胞TCR-seq来评估患者BALF中克隆扩增的状态。不出所料，CCR7+ T细胞作为幼稚或中央记忆细胞，几乎没有克隆扩增，而CD8+效应T细胞在不同T细胞亚群中显示出最高的扩增水平（图4A）。增殖T细胞和Treg细胞也显示出一定程度的扩增，但程度较低。

接下来，作者检查了COVID-19轻症和重症患者之间克隆扩增的比例，发现轻度疾病组的总T细胞和CD8+ T细胞的扩增水平均显着高于重症患者（图4B和4C）。平均而言，轻症组中超过50％的CD8+ T细胞是扩增的克隆，可能代表SARS CoV-2特异性T细胞，还显示出比重症患者更高的扩增指数（图4C）。在个体水平上，作者还发现与3名重症患者相比，3名轻度患者始终保持较高的T细胞克隆性（图4D），这表明高度扩增的CD8+ T细胞参与了SARS-CoV-2感染的清除。为了确认扩增的T细胞克隆的功能状态，研究团队在扩增的CD8+ T细胞与未扩增的细胞之间进行了GEX分析，发现信号和组织固有基因（包括XCL1、XCL2、ZNF683、HOPX、CXCR6和ITGAE等）的表达增加。这进一步支持了那些扩增的CD8+ T细胞的效应分子功能（图4E）。

图4. Analysis of the T cell clonal expansion in BALF of SARS-COV-2 infected patients

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感觉本文章和大多数单细胞文献一样，侧重于描述分析，概括起来主要观点有以下几个：

（1）与健康对照相比，COVID-19感染的患者存在更高比例的T和NK细胞，较低比例的上皮细胞。与轻症患者相比，重症患者含有更高的巨噬细胞比例，较低比例的T和NK细胞；
（2）在重症COVID-19患者中，肺巨噬细胞群体的平衡失调，表现为Group1 单核细胞衍生巨噬细胞（FCN1 +）、Group2和3 巨噬细胞（SPP1 +）显着增加，而Group 2 lung AM（FABP4+）几乎完全消失；
（3）与健康对照组相比，新冠患者中NK和T细胞比例明显增高 (图1F和3C）。与轻症患者相比，重症患者CD8+T细胞比例较低，增殖细胞比例较高 ；
（4）轻度疾病组的总T细胞和CD8+ T细胞的扩增水平均显着高于重症患者，表明克隆扩增的CD8+ T细胞的高效的效应分子水平；

[1]：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5835172/

文章解读：Tiger
文章校对：生信宝典

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