复杂三萜类天然产物柠檬苦素的完整生物合成途径被解析-轻识

大家好，本次分享的文献是美国斯坦福大学Elizabeth S. Sattely和英国约翰英纳斯中心（JIC）Anne Osbourn联合团队发表在Science上的文章，题目为“Complex scaffold remodeling in plant triterpene biosynthesis” 。

柠檬苦素类化合物（limonoids）是一类高度氧化的四环三萜类次生代谢产物，主要存在于芸香科（Rutaceae）和楝科（Meliaceae）植物中。这类化合物具有广泛的生物活性和结构多样性，目前已知的柠檬苦素结构有2800多种，它们都具有标志性的呋喃结构。据报道，大约90多种柠檬苦素具有抗昆虫活性，可用作生物杀虫剂；多种柠檬苦素可作用于哺乳动物的受体和信号途径。印苦楝子素（azadirachtin）源自印楝树，是生物农药的主要成分；它是一种有效的拒食剂（antifeedant），对超过600种昆虫具有活性。与此类似，其他柠檬苦素，如诺米林（nomilin）和黄柏酮（obacunone）等可在柑橘类植物中高水平积累，这也是造成柑橘类果汁具有“延迟苦味”的部分原因，并导致严重的全球柑橘汁行业经济损失。

图1 芸香科和楝科柠檬苦素类化合物的结构及其生物合成途径

迄今为止，柠檬苦素的生物合成仅阐明了从三萜共同前体2,3-oxidosqualene到protolimonoid melianol的前三个酶催化步骤（见图1）。利用已有数据库和RNA测序，作者首先在柑橘类植物甜橙（Citrus sinensis）中确定了一系列与次级代谢相关的候选基因，包括多个预测的CYPs、2-ODDs和乙酰转移酶。接着，作者对楝科的苦楝树（Melia azedarach）进行基因组和转录组测序，利用已报道的合成melianol的三个酶找到了17个候选基因（见图2）。

图2 柑橘属和楝属的基因组和转录组分析

以本氏烟草作为异源表达系统，作者将上述候选基因在烟草进行瞬时表达并分析其生物功能。结果显示，CYP88A可以催化melianol，但所得产物可能不稳定或被本氏烟草的内源性酶进一步修饰了。尽管在烟草表达前三个酶和CYP88A积累了多个相关代谢物，但可以继续验证共表达的候选基因。其中有一类酶是甾醇异构酶（sterol isomerase，SI），与植物甾醇和胆固醇生物合成有关，可以催化双键异构化。在特定的植物物种中，SI通常是单拷贝基因。而在甜橙和苦楝树分别发现4个和3个SIs。系统发育分析和酶功能验证结果显示，这些SI分为两支：其中一支包括CsSI和MaSI，功能保守，与植物甾醇合成有关；另一支包括CaMOI1/2/3和MaMOI1/2，与柠檬苦素合成有关。进一步研究发现，MOI可维持碳正离子中间体的稳定性，并将其异构化为两类柠檬苦素：CsMOI2、CsMOI3 和MaMOI2可以形成C-14/15双键从而产生经典柠檬苦素（classic limonoids），而CsMOI1形成环丙烷环骨架从而产生glabretal柠檬苦素（glabretal limonoids）（见图3）。（Note：由于苦楝树基因组注释的问题，MaMOI1基因序列无法扩增而无法进行功能验证）

图3 MOIs的功能验证

通过进一步鉴定催化下游产物的相关基因，作者发现L21AT和SDR具有广泛的底物特异性，L21AT可以将melianol 和apo-melianol 的C-21羟基乙酰化，而SDR则可以将OSC1产物后面所有中间体的C-3羟基氧化为酮，从而形成甜橙中kihadalactone A和苦楝树中azadirone的共同前体21-(S)-acetoxyl-apo-melianone (6)。接着，作者验证了CsCYP716AC1负责A环内酯的形成和CsCYP88A37负责C-1羟基化；而CsCYP88A37在苦楝树的一个同源基因MaCYP88A164能够直接催化化合物6的C-1羟基化。然后，乙酰转移酶L1AT和L7AT分别参与了接下来的两步乙酰化，从而形成了一个三酰基化的产物(12&13）。

然而，鉴定参与呋喃环形成中涉及C-4断裂的关键酶是十分困难的，目前还不清楚哪一类酶可以催化这类修饰。通过在烟草筛选，最终确定了三个候选基因：醛酮还原酶(AKRs)、CYP716ADs、2-ODDs（命名为limonoid furan synthase，LFS）。这些基因一起表达可以导致含呋喃分子的azadirone和kihadalacone A的积累。接着分别验证了AKR、CYP716AD和LFS的功能，从而完成了柠檬苦素类化合物azadirone和 kihadalactone A的生物合成（见图4）。

图4 azadirone 和 kihadalactone A 的完整生物合成途径

综上所述，该研究利用系统的基因组和转录组挖掘以及系统发育和同源分析，从柑橘和楝科植物中筛选出一系列柠檬苦素生物合成的候选基因。通过在本氏烟草中异源表达鉴定出22种酶的催化功能，它们可在azadirone和kihadalactone A的生物合成过程中催化12种不同的酶反应，从而揭示了柠檬苦素的完整生物合成途径。这些结果使合成有价值的柠檬苦素成为可能，有助于生产具有应用特性的天然和非天然柠檬苦素。

此外，复杂三萜类途径的重建有很多障碍，包括：不知道关键中间体的结构和骨架修饰步骤的顺序，通路上前体可能不稳定，候选基因太多等等。这篇文章中复杂结构柠檬苦素类化合物通路的解析是很好的参考，很值得我们去学习和借鉴。

本文作者：安宁

责任编辑：刘振华

原文链接：Complex scaffold remodeling in plant triterpene biosynthesis | Science

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